Tahapan dan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik perbanyakan DNA secara in vitro dalam waktu yang relatif singkat. Reaksi PCR dilakukan dalam suatu mesin pemanas yang diprogram secara otomatis disebut thermocycler. Mesin tersebut menyediakan kondisi termal yang diperlukan untuk proses amplifikasi. Teknik PCR berjalan secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Prinsip kerja PCR berdasarkan sifat dari DNA, yaitu jika DNA dipanaskan maka ikatan hidrogen pada untain ganda DNA akan putus sehingga DNA membentuk untaian tunggal. Ketika suhu kembali normal, ikatan hidrogen pada DNA kembali terbentuk. Proses yang terjadi dalam mesin PCR meliputi tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan elongasi.:

1. Denaturasi

Denaturasi merupakan proses memisahkan untaian ganda DNA menjadi untaian tunggal. Pada tahap ini DNA dipanaskan sampai mendekati titik didih air (± 95⁰C) untuk memutuskan ikatan hidrogen pada DNA. Untaian tunggal DNA yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi untai DNA baru.

2. Annealing

Annealing adalah proses penempelan primer yang merupakan urutan basa nukleotida pendek. Penempelan primer pada DNA template berfungsi untuk memulai replikasi DNA. Enzim Taq polimerase dapat memulai replikasi DNA baru jika primer telah menempel pada DNA template. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada DNA template, diperlukan suhu yang rendah sekitar 40⁰C-60 ⁰C selama 30-60 detik.

3. Elongasi

Elongasi adalah proses penambahan dNTP yang komplemen dengan DNA template oleh DNA polimerase. Proses tersebut akan memperpanjang primer telah menempel sebelumnya sehingga akan terbentuk untaian DNA baru. Tahap elongasi dilakukan pada suhu 72^oC.

Polymerase Chain Reaction, PCR ( Polymerase Chain Reaction), tahapan PCR (Polymerase Chain Reaction), proses PCR (Polymerase Chain Reaction), Denaturasi , Annealing, Elongasi, siklus PCR (Polymerase Chain Reaction)

Gambar 1. Ilustrasi Tahapan PCR (Polymerase Chain Reaction) yang terdiri dari 3 tahapan yaitu denaturasi, anealing san elongasi (extension)

Ketiga tahapan PCR tersebut diulang terus menerus hingga mendapatkan jumlah copy yang cukup untuk dideteksi, biasanya dilakukan hingga 30-40 siklus. Deoxyribonucleic acid (DNA) baru yang terbentuk akan bertambah secara eksponensial dan menjadi template pada siklus berikutnya.

Gambar 2. Deoxyribonucleic acid (DNA) baru yang terbentuk akan bertambah secara eksponensial dan menjadi template pada siklus berikutnya

Komponen dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu:

1. DNA template

DNA template adalah cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru. DNA template dapat berupa DNA inti, DNA kromosom, DNA plasmid, DNA mitokondria ataupun fragmen DNA.

2. Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki memiliki ukuran 10 sampai 40 bp dan merupakan komplementer dari DNA target. Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Primer berfungsi untuk mengawali proses perbanyakan DNA target dan menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses elongasi DNA.

3. DNA polimerase

DNA polimerase merupakan enzim yang stabil bekerja pada suhu tinggi. DNA polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap elongasi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim tersebut bersifat termostabil. Enzim tersebut stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu yang tinggi.

4. Bufer PCR dan MgCl₂

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu sehingga diperlukan buffer agar pH tetap stabil. Selain buffer, reaksi PCR juga memerlukan adanya ion Mg²⁺, ion tersebut berasal dari berasal MgCl². MgCl₂ bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase dan meningkatkan interaksi primer dengan DNA template.

5. Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs)

Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) adalah suatu campuran yang terdiri atas Deoksiadenosin Triphosphate (dATP), Deoksitimidin Triphosphate (dTTP), Deoksisitidin Triphosphate (dCTP) dan Deoksiguanosin Triphosphate (dGTP). Dalam proses PCR, dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses elongasi DNA. Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template.

Demikian penjelasan tentang Tahapan dan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction), semoga bermanfaat

Baca Juga :

Mitokondria dan Kloroplast

Pertumbuhan Reproduksi dan Rekombinasi bakteri.html

Kanker dan Pembelahan Sel

Kata kunci :

Polymerase Chain Reaction, PCR ( Polymerase Chain Reaction), tahapan PCR (Polymerase Chain Reaction), proses PCR (Polymerase Chain Reaction), Denaturasi , Annealing, Elongasi, siklus PCR (Polymerase Chain Reaction, komponen dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)