Protein atau Enzim yang Berperan dalam Replikasi DNA (baru)

  Seperti yang telah kita ketahui bersama bahwa replikasi DNA adalah proses penggandaan, penyalinan, atau pengcopian DNA dari suatu organisme. Dalam prosesnya, pilinan / untaian ganda dari DNA akan dibuka dan masing-masing untaian akan menjadi template/cetakan. Replikasi DNA sangat penting dalam pembelahan sel dan reproduksi, karena memastikan bahwa setiap sel turunan menerima salinan lengkap dari informasi genetik yang terkandung dalam DNA. Replikasi DNA juga memungkinkan sel untuk memperbaiki kerusakan pada molekul DNA yang dapat disebabkan oleh faktor internal dan eksternal, seperti radiasi dan bahan kimia berbahaya.

Proses Replikasi DNA secara detail dapat Anda baca dalam postingan Proses Replikasi DNA. Ada banyak enzim yang berperan dalam replikasi DNA. Berikut adalah beberapa enzim yang berperan dalam replikasi DNA bakteri.

1. Protein Helicase

Protein helicase adalah enzim yang memainkan peran penting dalam membuka dan memisahkan molekul DNA. Protein helicase menggunakan energi dari hidrolisis ATP untuk memecah ikatan hidrogen antar basa nitrogen sehingga double helix / pilinan DNA terpisah sehingga DNA dapat melakukan proses replikasi dan proses-proses lainnya.

Protein / enzim helicase yang berperan dalam replikasi DNA

2. Single-stranded binding protein (SSB) atau protein pengikat untai tunggal

Single-stranded binding protein (SSB) atau protein pengikat untai tunggal adalah merupakan enzim yang menjaga atau menstabilkan untangan tunggal DNA sehingga DNA tetap berbentuk untaian tunggal. Setelah protein helicase memecah untaian ganda DNA, masing-masing untaian di tempeli oleh Single-stranded binding protein agar DNA tersebut tidak membentuk untaian ganda lagi.

Single-stranded binding protein (SSB) atau protein pengikat untai tunggal

3. Topoisomerase

Topoisomerase merupakan salah satu enzim yang berperan dalam replikasi DNA. Fungsi dari topoisomerase secara umum adalah meregangkan ketegangan DNA. Topoisomerase memodifikasi struktur DNA sehingga tidak berbelit ketika akan direplikasi. Topoisomerase akan memotong salah satu dari dua untai ganda DNA, kemudian memutar salah satu untai DNA dan kemudian mengikat kembali ikatan-ikatan DNA yang terpotong. Hal tersebut menghilangkan tegangan pada molekul DNA, sehingga memungkinkan untai ganda DNA terurai dan disalin oleh polimerase. Setelah proses replikasi selesai, topoisomerase kemudian mengembalikan struktur DNA ke posisi semula dengan merekatkan kembali ikatan-ikatan yang telah dipotong. Oleh karena itu, topoisomerase memainkan peran penting dalam menjaga stabilitas dan integritas molekul DNA selama proses replikasi dan memastikan bahwa proses ini dapat berlangsung dengan lancar.

Topoisomerase memodifikasi struktur DNA sehingga tidak berbelit ketika akan direplikasi

4. Enzim Primase

Primase merupakan enzim yang sangat penting dalam proses replikasi DNA. Primase berperan mensintesis primer RNA. Primer RNA kemudian menjadi awalan bagi DNA polimerase untuk memulai sintesis untai DNA baru. Primer RNA yang disintesis oleh primase memiliki panjang sekitar 10-12 nukleotida. Tanpa adanya primase, replikasi DNA tidak dapat dimulai karena DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis untai DNA baru. 

Primase berperan mensintesis primer RNA

5. DNA polimerase III

DNA polimerase III berperan mensistesis untai DNA baru dengan menambahkan nukleotida pada Primer RNA atau nukleotida yang sudah ada. Fungsi utama DNA polimerase III adalah mensintesis untai DNA baru selama proses replikasi DNA. Selama replikasi, DNA polimerase III berinteraksi dengan molekul DNA yang sudah ada, membaca cetakan DNA tersebut, dan menambahkan nukleotida-nukleotida baru secara berurutan untuk membentuk untai DNA yang baru. DNA polimerase III memiliki kemampuan yang sangat tinggi dalam prosesivitas. DNA polimerase III juga memiliki kemampuan proofreading, yaitu untuk mendeteksi dan memperbaiki kesalahan yang mungkin terjadi selama proses replikasi DNA, sehingga menjaga akurasi replikasi.

DNA polimerase III berperan mensistesis untai DNA baru dengan menambahkan nukleotida pada Primer RNA atau nukleotida yang sudah ada

6. DNA polimerase I

Peran DNA polimerase I adalah mengganti primer RNA yang ada pada untaian DNA dengan Nukleotida DNA. Primer RNA yang dimaksud adalah primer RNA yang disintesis enzim primase saat awal terjadinya replikasi DNA.

Fungsi DNA polimerase I adalah mengganti primer RNA yang ada pada untaian DNA dengan Nukleotida DNA

7. DNA ligase

DNA ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menghubungkan fragmen-fragmen okizaki pada lagging strand. DNA ligase menggabungkan fragmen-fragmen DNA dengan cara membentuk ikatan fosfodiester antara gugus fosfat di ujung 3' dari satu fragmen dengan gugus hidroksil di ujung 5' dari fragmen lain.

DNA ligase (kanan) merupakan enzim yang berfungsi untuk menghubungkan fragmen-fragmen okizaki pada lagging strand

Demikian postingan tentang Protein atau Enzim yang Berperan dalam Replikasi DNA. Semoga Bermanfaat.

Read more

Alat dan bahan untuk ekstraksi DNA (Rangkaian analisis PCR)

 PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah reaksi perbanyakan DNA di dalam laboratorium. PCR saat ini sangat terkenal sejak terjadinya wabah COVID-19 karena konfirmasi positif penyakit COVID-19 harus menggunakan analisis PCR. Analisis PCR yang digunakan dalam pemeriksaan COVID-19 adalah Real Time PCR. Real Time PCR adalah analisis PCR yang hasilnya berbentuk grafik di layar komputer. Alat dan Bahan yang akan di bahas dalam artikel ini adalah PCR konvensional. PCR konvensional adalah PCR yang hasilnya ditampilkan dalam sebuah gel, gel tersebut dinamakan dengan gel agarose. Prinsip kerja dari Real Time PCR dan PCR konvensional adalah sama.

Polymerase chain reaction atau yang lebih dikenal dengan analisis PCR adalah suatu analisis molekuler yang berbasis DNA.  Polymerase Chain Reaction (PCR) dimanfaatkan dalam berbagai bidang, salah satunya adalah bidang kesehatan. Dalam bidang kesehatan, analisis PCR dimanfaatkan untuk deteksi / diagnosis penyakit. Baru baru ini, analisis PCR sedang populer karena merupakan suatu metode untuk melakukan diagnosis terhadap covid-19 (Corona). 

Baca Juga : Sekuensing DNA

Dalam suatu laboratorium, ada beberapa alat dan bahan yang harus tersedia untuk dapat melakukan atau menjalankan analisis PCR. Tenaga ahli merupakan hal paling penting yang harus ada untuk menjalankan analisis PCR. Tenaga ahli harus paham dan telah terlatih dalam menjalankan analisis PCR. Setelah tersedia tenaga ahli, maka harus ada alat dan bahan yang digunakan untuk berjalannya analisis PCR.

Ada 2 proses tahapan dalam rangkaian analisis PCR, yaitu ekstraksi / isolasi DNA, dan setelah DNA diperoleh, maka DNA dihibridisasi dengan PCR. 

Ekstraksi DNA adalah proses pemisahan DNA dari dalam sel. Singkatnya ada 3 langkah dalam isolasi / ekstraksi DNA yaitu pemecahan membran sel, pemisahan DNA dari organella sel dan pemurnian DNA.

Alat dan bahan dalam Ekstraksi DNA :

1. Kit ekstraksi DNA

Bahan-bahan untuk ekstraksi  DNA sebenarnya dapat diracik sendiri dengan bahan-bahan kimia yang ada di laboratorium, Kit Ekstraksi DNA adalah bahan-bahan untuk ekstraksi DNA yang telah diracik dari pabriknya sehingga tinggal menggunakannya saja. Penggunaan kit ekstraksi DNA lebih praktis dan menghemat waktu. Kekurangan dalam penggunaan kit ekstraksi DNA adalah biaya yang dikeluarkan lebih besar. Contoh kit ekstraksi DNA adalah produk dari promega dengan nama Promega wizard Genomic DNA Purification Kits.

Contoh Kit Ekstraksi DNA 

2. Isopropanol

Isopropanol adalah senyawa kimia yang dalam ekstraksi DNA berfungsi untuk pengendapkan DNA agar terpisah dari larutan. Hampir semua kit ekstraksi DNA tidak menyertakan isopropanol dalam paketnya sehingga perlu disediakan sendiri.

3. Ethanol 70%

Ethanol adalah senyawa kimia yang dalam ekstraksi DNA berfungsi untuk memurnikan atau membersihkan DNA dari kotoran. Sama dengan isopropanol, hampir semua kit ekstraksi DNA tidak menyertakan ethanol 70% dalam paketnya sehingga perlu disediakan sendiri.  

Baca Juga : Kloning DNA / Gen pada Bakteri dengan Memanfaatkan Enzim Restriksi dan DNA Ligase

4. Mikropipet dan tip

Mikropipet dan tip adalah alat yang digunakan untuk mengambil larutan dengan volume tertentu. Ada beberapa variasi mikropipet. Ada beberapa variasi ukuran mikropipet, diantaranya :

• Mikropipet ukuran 10 uL, digunakan untuk mengambil larutan dengan volume 0,5 ul hingga 10 uL.
• Mikropipet ukuran 20 uL, digunakan untuk mengambil larutan dengan volume 2 ul hingga 20 uL
• Mikropipet ukuran 200 uL, digunakan untuk mengambil larutan dengan volume 20 ul hingga 200 uL
• Mikropipet ukuran 1000 uL, digunakan untuk mengambil larutan dengan volume 200 ul hingga 1000 uL.

Contoh gambar mikropipet

Tip mikropipet adalah alat yang dipasangkan pada mikropipet. Tips merupakan aksesoris dari mikropipet yang akan kontak langsung dengan cairan. Untuk menghindari kontaminasi, tips langsung dibuang setelah dipakai. 

Mikropipet dan tip

5. Mikrotube

Mikrotube adalah tabung kecil untuk menaruh larutan. Mikrotube yang sering dipakai untuk ekstraksi DNA biasanya berukuran 1,5 ml (maksimal dapat menampung 1,5 ml) sedangkan mikrotube yang dipakai untuk reaksi PCR berukuran 0,2 ml (maksimal dapat menampung 0,2 ml).

Mikrotube ukuran 1,5 uL

6. Sentrifugase

Sentrifugase adalah alat yang digunakan untuk mengendapkan komponen-komponen tersebar dalam suatu larutan.

Contoh gambar microsentrifuge 

7. Waterbath

Dalam ekstraksi DNA, perlu beberapa langkah yang harus menginkubasi sampel dalam suhu tertentu. Waterbath adalah pemanas air yang suhunya dapat diatur sesuai dengan suhu yang diinginkan. Langkah inkubasi dilakukan dengan menggunakan waterbath.

Waterbath untuk inkubasi sampel

Demikian postinga tentang Alat dan bahan untuk ekstraksi DNA (Rangkaian analisis PCR).

Semoga bermanfaat.

Read more

Uji Kualitas DNA

DNA ( deoxyribonucleic acid) merupakan molekul yang mempunyai peran sangat penting. Peran DNA tersebut adalah sebagai pembawa materi genetik dari suatu organisme. Saat ini telah berkembang berbagai analisis yang berbasis pada DNA. Analisis berbasis DNA adalah analisis yang melakukan pemeriksaan pada DNA. Sebagai contoh adalah pemeriksaan virus corona atau covid-19 yang menggunakan analisis PCR (Polymerase chain reaction). Analisis PCR adalah analisis yang berbasis pada DNA. 

Analisis DNA mempunyai kelebihan yaitu hasilnya sangat akurat. Beberapa ahli menyebutkan bahwa analisis DNA mempunyai keakuratan hingga 99%. Kelebihan analisis DNA dibanding dengan analisis lain adalah DNA pada hampir seluruh sel makhluk hidup dan sifatnya spesifik terhadap setiap spesies bahkan setiap individu. 

Baca Juga : Uji Konsentrasi DNA

DNA dapat dijumpai hampir pada semua sel makhluk hidup. Ada dua jenis sel, yaitu sel prokariotik dan eukariotik. Sel prokariotik adalah sel yang tidak punya selaput inti sel sedangkan sel eukariotik adalah sel yang mempunyai selaput inti (inti sel). Pada sel eukariotik DNA terletak dalam inti sel sedangkan pada sel prokariotik DNA terletak pada sitoplasma dan terkonsentrasi pada suatu daerah tertentu yang disebut dengan nukleoid.

Dalam analisis DNA, diperlukan suatu langkah untuk memisahkan DNA dari sel. Langkah tersebut dinamakan dengan isolasi DNA atau ekstraksi DNA. Baik buruknya hasil hasil isolasi DNA disebut kualitas DNA. Hasil isolasi DNA yang kualitasnya baik adalah hasil DNA tersebut murni tanpa kontaminasi protein, fenol atau RNA. Kontaminasi DNA dapat berasal dari organela sel atau dari reagen-reagen yang digunakan dalam isolasi tersebut. Reagen – reagen tersebut menjadi kontaminan karena terjadi kesalahan dalam prosedur isolasi DNA yang dilakukan. 

Pengukuran kualitas DNA dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Spektrofotometer adalah alat bekerja berdasarkan serapan panjang gelombang. DNA mempunyai serapan tertinggi terhadap berkas cahaya pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein mempunyai serapan tertinggi terhadap berkas cahaya pada panjang gelombang 280 nm sehingga karakteristik tersebut dimanfaatkan untuk mengukur kualitas DNA. Berikut adalah gambaran dari serapan terhadap cahaya dari protein murni, DNA murni dan campuran antara DNA dan protein. Terlihat bahwa puncak serapan DNA murni terjadi pada panjang gelombang 260 nm dan puncak serapan protein murni terjadi pada panjang gelombang 280 nm.

Perbandingan scan panjang gelombang  DNA dan protein

Berdasarkan prinsip tersebut, didapatkan rumus untuk menghitung kualitas DNA, yaitu : 

Kualitas DNA = (Panjang gelombang 260 nm)/(Panjang gelombang 280 nm)

Jika hasilnya =

* 1,7-2,0 = kualitas DNA baik.

* < 1,7  = kontaminasi protein

* > 2 = kontaminasi RNA

Baca Juga : Kloning DNA / Gen pada Bakteri dengan Memanfaatkan Enzim Restriksi dan DNA Ligase

Contoh :

Absorbansi hasil pengukuran DNA menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm adalah 0,106 dan panjang gelombang 280 adalah 0,065. Bagaimana kualitas DNA tersebut?

Jawab :

Kualitas DNA = (Panjang gelombang 260 nm)/(Panjang gelombang 280 nm)

= 0,106/0,065

= 1,6

Hasil dari perhitungan rumus tersebut adalah 1,6. Karena 1,6 <1,7 sehingga sampel DNA yang diukur tersebut terdapat banyak kontaminan yang berupa protein. 

Demikian postingan tentang Uji Kualitas DNA, SEMOGA BERMANFAAT

Read more

Uji Konsentrasi DNA

Konsentrasi DNA jumlah DNA yang terlarut dalam suatu larutan pelarut. Uji konsentasi DNA adalah suatu uji yang dilakukan untuk mengetahui berapa jumlah DNA yang ada dalam suatu larutan. Uji konsentrasi DNA biasanya merupakan rangkaian dari proses isolasi DNA. DNA adalah suatu materi yang terdapat di dalam hampir semua sel makhluk hidup. DNA merupakan suatu materi genetik dan berperan dalam pewarisan sifat pada keturunannya. Salah satu penyusun dari DNA adalah basa nitrogen. Ada 4 jenis basa nitrogen yaitu guanin, sitosin, adenin dan timin. Tiap-tiap molekul DNA saling berikatan membentuk untaian DNA. Urutan basa nitrogen dari untaian DNA tersebut mengkodekan suatu sifat dari organisme yang selanjutnya diwariskan pada keturunannya. Karena perannya tersebut, saat ini DNA banyak dimanfaatkan sabagai dasar suatu analisis.

Beberapa analisis yang saat ini telah berbasis pada analisis DNA adalah identifikasi mayat, uji bapak kandung, dan berbagai pengujian lain. Langkah yang harus dilalui dalam suatu analisis yang berbasis DNA adalah isolasi atau ekstraksi DNA. DNA yang didapatkan dari isolasi DNA merupakan DNA yang terlarut pada pelarut. Pelarut untuk DNA biasanya adalah buffer TE (Tris-EDTA) atau aquadest.

Jumlah konsentrasi DNA hasil isolasi DNA tergantung dari jumlah sel yang diisolasi DNA nya, oleh karena itu untuk pengujian lebih lanjut perlu dilakukan pengukuran konsentrasi DNA. Salah satu uji lanjut yang hampir selalu dilakukan dalam analisis berbasis DNA adalah analisis PCR. Dalam analisis PCR, Konsentrasi DNA yang digunakan perlu diketahui terlebih dahulu karena konsentrasi DNA menentukan keberhasilan analisis PCR.

Baca Juga : Design Primer untuk PCR (Polimerase Chain Reaction)

DNA merupakan molekul yang berukuran sangat kecil sehingga tidak bisa dilakukan penghitungan langsung. Oleh karena itu proses penghitungan konsentrasi DNA memanfaatkan dari sifat DNA tersebut. Perlu diketahui bahwa suatu molekul atau senyawa mempunyai serapan yang khas terhadap berkas cahaya. Begitu juga dengan DNA, molekul DNA mampu menyerap berkas cahaya secara maksimal pada panjang gelombang 260 nanometer (nm). Hal tersebut dimanfaatkan untuk mengukur konsentrasi DNA dan alat yang dipakai adalah spektrofotometer.

Saat ini ada spektrofotometer khusus yang digunakan untuk mengukur konsentrasi DNA. Kelebihan dari spektrofotometer khusus tersebut adalah tidak membutuhkan kuvet seperti umumnya spektrofotometer dan tidak membutuhkan banyak sampel. Sampel yang digunakan cukup 1-2 µl. Sampel sebanyak 1-2 µl tersebut cukup diteteskan pada tempat sampel. Contoh merk dari spektrofotometer khusus untuk mengukur konsentrasi DNA tersebut salah satunya adalah NanoVue Plus Spectrophotometer.

Spektrofotometer khusus untuk DNA

Pengukuran konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer biasa yang menggunakan kuvet memerlukan beberapa tambahan langkah kerja. Tambahan langkah kerja tersebut adalah harus melakukan pengenceran dan perhitungan menggunakan rumus.

 Langkah tambahan dalam pengukuran tersebut adalah harus melakukan pengenceran dan penghitungan. Pengenceran yang dilakukan biasanya 10 hingga 100 x dan menggunakan aquadest steril. Kuvet spektrofotometer mempunyai kapasitas volume yang bermacam-macam sehingga volume larutan DNA yang dilarutkan tergantung dari kuvetnya.

Macam-macam ukuran kuvet

Misalnya =

* Pengukuran menggunakan kuvet 5 ml yang akan diisi sebanyak 3 ml. DNA diencerkan 100 x, maka pengenceranya adalah 30 µl DNA + 2970 µl  aquadest.

* Pengukuran menggunakan kuvet 1,5 ml yang akan diisi sebanyak 1 ml. DNA diencerkan 100 x, maka pengenceranya adalah 10 µl DNA + 990 µl aquadest.

 Baca Juga : Tahapan dan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)

Setelah diencerkan, dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm. Hasil pengukuran yang berupa nilai absorbansi kemudian dikonversi menjadi jumlah konsentrasi DNA dengan rumus =

Konsentrasi DNA (ug/ml) =  Absorbansi  λ 260 X faktor pengenceran X 50

50 adalah tetapan dari konsentrasi DNA, dihasilkan dari : 

A₂₆₀ of 1.0 = 50µg/ml pure dsDNA

artinya absorbansi 1,0 sampel DNA pada pengukuran spektrofotometer λ260 memiliki kandungan (konsentrasi) DNA sebanyak 50 ug/ml.

Contoh perhitungan =

Hasil pengukuran suatu sampel DNA dengan pengenceran100 kali pada panjang gelombang 260 adalah 0,0467 maka perhitungannya :

Konsentrasi DNA (ug/ml) =  Absorbansi  λ 260 X faktor pengenceran X 50

= 0,0467 x 100 x 50 = 233,5 ug /ml

Jadi Konsentrasi DNA dari contoh hasil pengukuran tersebut adalah 233,5 ug /ml.

Demikian postingan kali ini tentang Uji Konsentrasi DNA. SEMOGA BERMANFAAT

Read more

Design Primer untuk PCR (Polimerase Chain Reaction)

Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah analisis yang saat ini banyak dilakukan untuk berbagai kepentingan. Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah perbanyakan suatu fragmen DNA yang dinginkan secara invitro.

 Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) merupakan analisis yang berbasis pada DNA (Deoxyribonucleic acid) sehingga memiliki tingkat keakuratan yang tinggi. Adapun pembahasan tentang PCR dapat dibaca pada postingan Tahapan dan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction). 

Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) memerlukan suatu primer. Primer pada Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) berperan untuk memulai atau menginisiasi hibridisasi DNA pada tahapan PCR (Polimerase Chain Reaction). Sebelum melakukan analisis PCR (Polimerase Chain Reaction), perlu dilakukan desain primer terlebih dahulu untuk menentukan DNA target yang ingin diperbanyak.

Baca Juga : Penyebab Point Mutation (Mutasi titik) pada DNA

Keberhasilan dalam melakukan analisis PCR (Polimerase Chain Reaction)  sangat ditentukan dari primer yang digunakan. Perancangan/desain primer harus memperhatikan beberapa hal agar hasil PCR (Polimerase Chain Reaction) sesuai dengan target yang diinginkan. Adapun hal-hal yang harus diperhatikan dalam mendesain primer adalah sebagai berikut :

a. Panjang Primer PCR

Primer PCR idealnya memiliki panjang antara 18 sampai 30 oligonukleotida. Panjang tersebut diharapkan cukup untuk dapat mengikat DNA template pada suhu annealing dan mendapatkan sequen yang spesifik. Panjang primer ideal berkisar 18 -30 basa didasarkan pada pertimbangan kombinasi acak yang mungkin ditemukan pada satu urutan genom. Probabilitas menemukan 1 basa A, G, C atau T pada satu basa adalah ¼ (4^-1), probabilitas menemukan 2 urutan basa nitogen (AG, AC, CG, dll) adalah 1/16 (4^-2), probabilitas menemukan 4 urutan basa nitrogen (ACGT, CGAT, dll) adalah 1/256 (4^-4). Sehingga 17 basa primer secara statistik akan ditemukan sekali dalam setiap 4¹⁷ urutan basa nitrogen. Penggunaan primer   lebih dari 30 basa tidak disarankan karena tidak akan menunjukkan spesifisitas yang lebih tinggi. Selain itu, primer PCR yang terlalu panjang dapat berakibat terhibridasi dengan primer lain sehingga tidak terjadi polimerisasi DNA.

b. Primer Melting Temperature (Tm)

Primer Melting Temperature (Tm) adalah  suhu  yang diperlukan oleh primer PCR untuk mengalami disosiasi / lepas ikatan. Idealnya, Tm berkisar antara 52-58^oC. Primer PCR dengan Tm yang terlalu tinggi  akan mengurangi efektifitas anealing sehingga proses amplifikasi DNA kurang berjalan baik. Sedangkan Tm yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel ditempat lain sehingga menghasilkan produk yang tidak spesifik. Terdapat beberapa rumus yang dipakai untuk menentukan Tm suatu primer, salah satunya adalah Rumus Wallace. Rumus Wallace merupakan rumus yang sering dipakai karena perhitungannya cukup mudah. Adapun perhitungan rumus Wallace adalah sebagai berikut :

Tm_w (P) = (nG + nC) *4 + (nA+nT) *2

Keterangan :

                  Tm_w (P)      = Suhu Tm berdasarkan rumus Wallace

                    nG            = Jumlah basa nitrogen G pada primer

                    nC            = Jumlah basa nitrogen C pada primer           

                    nA            =  Jumlah basa nitrogen A pada primer

Baca Juga : Penyebab Penyakit Kanker (Oncogen, Proto-oncogen dan Tumor-Suppressor Gen

c. Primer Annealing Temperatur (Ta)

Primer Annealing Temperature (Ta) merupakan suhu ideal  agar primer dapat berkaitan dengan DNA template dengan stabil. Suhu annealing yang terlalu tinggi akan menyulitkan terjadinya ikatan primer PCR sehingga menghasilkan produk PCR yang kurang efisien. Sebaliknya, suhu anneling yang terlalu rendah menyebabkan terjadinya penempelan primer pada DNA di tempat yang tidak spesifik. Perhitungan Ta adalah sebagai berikut :

            Ta = 0.3 * Tm (primer) + 0.7 * Tm (produk)

            Keterangan :

            Ta                    :  Primer Annealing Temperatur

            Tm (primer)     : Tm primer PCR

            Tm (produk)    : Tm hasil PCR

d. Jumlah basa GC dalam primer PCR

Jumlah basa GC merupakan banyak basa Guanin (G) dan Sitosin (C) yang terdapat dalam suatu primer PCR. Jumlah basa ideal dalam suatu primer adalah 40%-60%. Primer PCR dengan jumlah GC yang rendah dapat menurunkan efisiensi proses PCR yang disebabkan karena primer PCR tidak mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada DNA template.

e. GC Clamp dalam primer PCR

GC clamp adalah jumlah basa Guanin (G) dan Sitosin (C) yang terdapat pada 5 basa terakhir (3’). GC clamp yang bagus adalah sekitar 3 basa G atau C. Keberadaan basa G dan C pada ujung 3’ sangat membantu terjadinya stabilitas ikatan antara primer PCR dengan DNA template.

Baca Juga : Rangkaian penelitian untuk mengungkap struktur DNA

f. Secondary Structures dalam primer PCR

Secondary structures adalah terjadinya interaksi antar primer PCR yang menyebabkan primer PCR tidak bisa berikatan dengan DNA template sehingga secondary Structures harus dihindari. Secondary structures disebabkan karena antara primer atau basa dalam sebuah primer saling komplementer  dan membentuk suatu ikatan. Ada beberapa macam  secondary structures dari primer, yaitu :

1.  Hairpin dalam primer PCR

Hairpin adalah terjadinya ikatan antar basa nitogen dalam suatu primer  PCR sehingga primer tersebut membentuk suatu loop.

2. Self Dimer dalam primer PCR

Self Dimer adalah terjadinya ikatan antar primer PCR yang sejenis. Forward primer berikatan dengan forward primer lain atau reverse primer berikatan dengan reverse primer lain.

3. Cross Dimer dalam primer PCR

Cross Dimer adalah  terjadinya ikatan antara forward primer dan   reverse primer dalam primer PCR.

Secondary structures dalam primer PCR yang perlu dihindari; a). Hairpain primer PCR, b). self dimer primer PCR, c). Cross Dimer dalam primer PCR

Demikian Postingan tentang Design Primer untuk PCR (Polimerase Chain Reaction). Semoga Bermanfaat.

Kata Kunci :

PCR, Polimerase Chain Reaction, hal yang harus diperhatikan dalam design primer, PCR adalah, berapa Panjang Primer PCR, Primer Melting Temperature (Tm) adalah, annealing primer, Jumlah basa GC dalam primer PCR, GC Clamp dalam primer PCR, Jumlah basa Guanin dan sitosin PCR, Struktur sekunder PCR

Read more

Deoxyribonucleic acid (DNA), DNA inti, DNA Mitokondria dan Gen Sitokrom b

Deoxyribonucleic acid (DNA)

Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah suatu materi pembawa informasi genetik  yang terdapat pada manusia dan semua makhluk hidup. Semua makhluk hidup mempunyai penyusun Deoxyribonucleic acid (DNA) yang sama, yaitu terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa dan basa nitrogen. Perbedaannnya hanya terletak pada urutan basa nitrogen yang terdiri dari Adenin (A), Timin (T), Guanin (G) dan Sitosin (C). Keempat basa nitrogen tersebut di dalam DNA tidak berjumlah sama rata tetapi Adenin selalu berpasangan dengan Timin dan Guanin selalu berpasangan dengan Sitosin sehingga jumlah Adenin akan selalu sama dengan jumlah Timin begitu juga jumlah Adenin akan selalu sama dengan jumlah Sitosin.

Baca Juga : Rangkaian penelitian untuk mengungkap struktur DNA

Pasangan basa Adenin dan Timin berikatan membentuk 2 ikatan hidrogen sedangkan pasangan basa Guanin dan Sitosin berikatan membentuk 3 ikatan hidrogen. Masing-masing pasangan basa nitrogen terhubung ke suatu deoksiribosa yaitu gula ribosa (5 atom karbon) yang kehilangan 2 atom oksigen pada atom karbon ke-2. Deoksiribosa juga berikatan dengan gugus fosfat, pada atom karbon ke-5.

Deoxyribonucleic acid (DNA) tersusun dari gugus fosfat, deoksiribosa dan basa nitrogen Adenin, Timin, Guanin, dan .Sitosin 

DNA Inti dan DNA Mitokondria

Deoxyribonucleic acid (DNA) dibedakan menjadi dua, yaitu DNA inti dan DNA mitokondria. DNA inti adalah DNA yang terletak di dalam inti sel sedangkan DNA mitokondria adalah DNA yang terletak dalam matriks mitokondria. Mitokondria  merupakan salah satu organel  sel yang berfungsi untuk  penghasil  energi dan terdapat  dalam sitoplasma. DNA mitokondria memiliki karakteristik yang berbeda DNA inti. DNA mitokondria  berbentuk  sirkuler, beruntai ganda.

Baca Juga : Jenis-Jenis Sekuensing DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) mitokondria manusia memiliki panjang sekitar 16.569 pasang basa. Kandungan basa Guanin dan Sitosin pada DNA mitokondria berkisar  antara  32-45.6 %.  Kedua  basa  tersebut  menyebar tidak  merata  diantara  kedua  untai  DNA sehingga  menimbulkan  heavy  strand  (H-strand)  dan  light  strand  (L-strand). Heavy strand berisi  lebih  banyak  basa Guanin yang  mempunyai  berat  molekul terbesar diantara nukleotida lain, sedangkan Light strand berisi lebih sedikit basa Guanin.

Gen - Gen dalam DNA mitokondria

Ada beberapa karakteristik DNA mitokondria  yang tidak dimiliki oleh DNA inti. Salah satunya adalah DNA mitokondria mempunyai jumlah salinan yang tinggi. Setiap sel dapat memiliki ratusan mitokondria dan tiap-tiap mitokondria memiliki 4-5 salinan DNA mitokondria sehingga satu sel dapat memiliki ribuan salinan DNA mitokondria. Seperti pada sel ovum namun  rata-rata diperkirakan  terdapat  sekitar  500 salinan DNA mitokondria dalam  setiap  sel.

Jumlah salinan DNA mitokondria yang tinggi menjadikan  keberhasilan  isolasi  DNA mitokondria  lebih  besar  jika dibandingkan dengan isolasi DNA inti. Isolasi DNA mitokondria juga dapat dilakukan pada sampel-sampel biologis yang telah mengalami kerusakan dan tidak mungkin dilakukan analisis DNA inti karena DNA inti telah mengalami degradasi karena faktor lingkungan.

Gen Sitokrom b

Gen sitokrom b mengkodekan protein sitokrom b yang merupakan protein struktural pada mitokondria. Protein sitokrom b merupakan salah satu dari 11 komponen penyusun complex III dalam rangkain fosfolarisasi oksidatif. Pada fosfolarisasi oksidatif, senyawa gula sederhana diubah menjadi adenosine tripospate (ATP) yang merupakan sumber energi. Dalam DNA mitokondria manusia, gen sitokrom b mempunyai panjang 1140 bp terletak pada  urutan basa ke 14,747 hingga 15,887.

Gen sitokrom b memiliki keunikan yaitu variasinya sangat terbatas dalam satu spesies (conserved) dan sangat besar antara satu spesies dengan spesies lainnya.

Variasi tersebut meliputi variasi panjang sequen dan variasi urutan sequen. Variasi panjang sequen tidak terlalu signifikan karena hanya berbeda 1 sampai 10 basa saja bahkan beberapa spesies memiliki jumlah yang sama. Namun terjadi variasi urutan sequen yang cukup besar antarspesies yang kekerabatannya dekat.

Baca Juga : Kloning DNA / Gen pada Bakteri

Manusia, Sipanse (Pan troglodytes), Gorilla (Gorilla gorilla) dan monyet (Macaca sylvanus) yang merupakan ordo Primata mempunyai perbedaan urutan  basa nitrogen cukup tinggi, perbedaan masing-masing adalah 11 % ,12 %, 20 %. Variasi urutan basa nitrogen gen sitokrom b akan semakin besar jika tingkat kekerabatan spesies tersebut semakin jauh, misalnya manusia dengan ayam (Gallus gallus) mempunyai perbedaan urutan basa nitrogen hingga 26 %.

Sifat DNA mitokondria tersebut telah dimanfaatkan untuk membedakan spesies dari berbagai mamalia termasuk manusia. Salah satu pemanfaatan gen sitokrom b tersebut adalah untuk identifikasi campuran sampel dari berbagai spesies dengan metode PCR (Polimerase Chain Reaction) menggunakan primer spesifik sitokrom b.

Sampel yang telah berhasil diidentifikasi dengan memanfaatkan gen sitokrom b dan metode PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah campuran daging tikus (Ratus norvegicus) pada bakso, percampuran daging kuda, keledai dan babi yang telah diolah menjadi sosis serta percampuran antara darah manusia dan darah hewan. 

Demikian Postingan tentang Deoxyribonucleic acid (DNA), DNA inti, DNA Mitokondria dan Gen Sitokrom b. Semoga bermanfaat

Kata Kunci :

Gen - Gen dalam DNA mitokondria, Struktur DNA, DNA adalah, macam-macam DNA, DNA inti adalah, DNA mitokondria, gen sitokrom b adalah, jenis jenis basa nitrogen, pasangan basa nitrogen, identifikasi DNA.

Read more

Kloning DNA / Gen pada Bakteri dengan Memanfaatkan Enzim Restriksi dan DNA Ligase

Perkembangan ilmu biologi molekuler saat ini semakin pesat. Ilmu biologi molekuler mempelajari aspek – aspek biologi pada tingkatan molekul. Seperti mempelajari tentang DNA, RNA, protein dan suatu gen tertentu. Gen adalah suatu rangkaian DNA (nukleotida) yang mengkodekan asam amino (protein). Para peneliti kesulitan ketika akan meneliti suatu gen tertentu karena gen terletak pada rangkaian DNA (nukleotida) yang sangat panjang. Bahkan dalam satu rangkaian DNA (nukleotida) dapat memiliki ratusan hingga ribuan gen. Kesulitan tersebut bertambah ketika yang akan dipelajari adalah gen pada genom eukariotik, contohnya pada manusia karena gen pada eukariotik hanya 1/100.000 dari seluruh DNA genom sedangkan sisanya adalah rangkaian DNA (nukleotida) yang tidak menyandikan protein (non-coding DNA). Antara gen dan non-coding DNA sulit dibedakan karena hanya berbeda kombinasi urutan basa nitrogennya.

Oleh karena itu, untuk mempelajari suatu gen tertentu, para peneliti menggunakan metode yang sering disebut dengan kloning DNA. Kloning DNA adalah metode untuk memperbanyak fragmen DNA (gen) sehingga mudah diamati dan dipelajari. Salah satu teknik cloning DNA adalah menggunakan bakteri Escherichia coli.

Baca Juga : Kontrol ekspresi gen pada Bakteri

Bakteri Escherichia coli mempunyai 2 jenis DNA, yaitu DNA kromosom dan DNA plasmid. DNA plasmid adalah DNA pada bakteri yang berbentuk sirkuler dan hanya berukuran kecil. DNA plasmid terpisah dari DNA kromosom bakteri namun terkadang DNA plasmid dapat menyatu / terintegrasi dalam DNA kromosom bakteri.

DNA plasmid tersebut yang dimanfaatkan oleh para peneliti untuk kloning DNA. Dengan suatu teknik tertentu, DNA plasmid diisolasi dari bakteri kemudian plasmid tersebut disisipi dengan gen tertentu yang diingikan sehingga terbentuk plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan adalah plasmid bakteri yang telah disisipi gen tertentu. Plasmid rekombinan yang telah dibuat kemudian dimasukkan ke dalam bakteri lagi sehingga terbentuk bakteri rekombinan. Bakteri rekombinan adalah bakteri yang telah memiliki plasmid rekombinan atau dengan istilah lain bakteri yang memiliki gen asing dalam genom nya.

Suatu gen dari luar yang dimasukan ke genom bakteri rekombinan akan ikut dikopi ke bakteri anakan ketika suatu bakteri melakukan pembelahan diri. Selain itu, protein atau enzim yang dikodekan oleh gen tersebut juga akan diakspresikan dalam bakteri tersebut. Sebagai contoh jika gen yang dimasukkan (dikloning) ke dalam genom bakteri rekombinan adalah gen penghasil hormon insulin maka bakteri tersebut mampu akan mampu memproduksi insulin. Hormon insulin tersebut kemudian dapat diekstraksi dari bakteri rekombinan dan dapat digunakan untuk berbagai kepentingan. Hormon insulin yang dihasilkan oleh bakteri rekombinan mempunyai kualitas yang sama dengan hormon insulin yang dihasilkan oleh manusia (asal gen).

Kloning gen pada bakteri, termasuk kloning gen penghasil insulin dalam genom bakteri Escherichia coli mempunyai banyak keuntungan. Salah satu keuntungannya adalah perkembangbiakan bakteri relatif cepat sehingga gen dengan cepat dapat diperbanyak dan protein yang diekspresikan dengan cepat dapat dihasilkan.

Kloning DNA / gen pada bakteri dapat dimanfaatkan untuk berbagai kebutuhan guna memecahkan permasalahan dalam kehidupan manusia, seperti memproduksi hormon pertumbuhan dari bakteri Escherichia coli untuk mentreatmen anak kekurangan gizi (stunting) dan memproduksi hormon insulin dari bakteri Escherichia coli seperti yang telah dijelaskan diatas.

Selain itu Kloning DNA dapat juga dimanfaatkan untuk kepentingan riset dasar, seperti untuk mengembangkan tanaman tahan herbisida, mengembangkan bakteri rekombinan yang dapat membersihkan limbah dan lain – lain.

Gambar 1. (1) Kloning DNA adalah menyisipkan gen dalam plasmd bakteri, (2) kemudian plasmid tersebut dimasukkan ke dalam bakteri (3) bakteri rekombinan kemudian ditumbuhkan dan dibiakkan (4) protein dan copi gen yang dihasilkan oleh bakteri bisa dimanfaatkan untuk berbagai kepentingan seperti untuk menghasilkan suatu hormon/protein dan untuk penelitian dasar.

Enzim Restriksi dan DNA Ligase

Kloning gen dan rekayasa genetika tidak lepas dari suatu enzim yang disebut dengan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang dapat memotong DNA membentuk suatu potongan – potongan DNA. Enzim restriksi tersebut dapat ditemukan secara alami pada suatu bakteri. Fungsi enzim restriksi dalam bakteri adalah untuk menghancurkan DNA – DNA asing yang masuk, seperti DNA dari bakteriofage yang menginfeksinya. Enzim restriksi memotong DNA pada ikatan antara gugus gula dan gugus fosfat antar nukleotida.

Enzim restriksi dalam kloning gen atau kloning DNA dimanfaatkan untuk memotong DNA plasmid. Saat ini telah banyak ditemukan berbagai enzim restriksi. Enzim-enzim restriksi tersebut mempunyai situs pemotongan yang berbeda-beda. Salah satunya enzim restriksi dinamakan dengan EcoRI. EcoRI mempunyai 1 situs pemotongan dalam plasmid bakteri Escherichia coli.

Untuk membuat plasmid rekombinan, Plasmid bakteri dan gen yang akan disisipkan pada plasmid dipotong menggunakan enzim restriksi (EcoRI). Fragmen gen yang telah dipotong kemudian sisipkan ke dalam plasmid. Untuk menyambungkan DNA plasmid dan fragmen gen digunakan DNA ligase. DNA ligase adalah suatu enzim yang dapat mengkatalis pembentukan ikatan gugus gula dan gugus fosfat pada potongan – potongan DNA. Setelah DNA plasmid dan gen disatukan oleh enzim restriksi maka terbentuknya suatu plasmid rekombinan. 

Gambar 2. Pembuatan plasmid rekombinan memanfaatkan enzim restriksi yang dapat memotong DNA dan DNA ligase yang dapat menyambungkan potongan DNA

Demikian postingan tentang Kloning DNA / Gen pada Bakteri dengan Memanfaatkan Enzim Restriksi dan DNA Ligase. Semoga bermanfaat.

Kata Kunci :

gen adalah, non-coding DNA, Kloning DNA, Kloning DNA adalah, DNA kromosom dan DNA plasmid bakteri, jenis DNA bakteri, DNA plasmid, pengertian DNA plasmid, plasmid rekombinan, plasmid rekombinan adalah, pengertian plasmid rekombinan, bakteri rekombinan, bakteri rekombinan adalah, pengertian bakteri rekombinan, Kloning gen pada bakteri, manfaat kloning, Enzim Restriksi dan DNA Ligase, Enzim restriksi adalah, pengertian Enzim, restriksi, Enzim restriksi pada bakteri, DNA ligase adalah, pengertian DNA ligase

Read more