Uji Konsentrasi DNA

Konsentrasi DNA jumlah DNA yang terlarut dalam suatu larutan pelarut. Uji konsentasi DNA adalah suatu uji yang dilakukan untuk mengetahui berapa jumlah DNA yang ada dalam suatu larutan. Uji konsentrasi DNA biasanya merupakan rangkaian dari proses isolasi DNA. DNA adalah suatu materi yang terdapat di dalam hampir semua sel makhluk hidup. DNA merupakan suatu materi genetik dan berperan dalam pewarisan sifat pada keturunannya. Salah satu penyusun dari DNA adalah basa nitrogen. Ada 4 jenis basa nitrogen yaitu guanin, sitosin, adenin dan timin. Tiap-tiap molekul DNA saling berikatan membentuk untaian DNA. Urutan basa nitrogen dari untaian DNA tersebut mengkodekan suatu sifat dari organisme yang selanjutnya diwariskan pada keturunannya. Karena perannya tersebut, saat ini DNA banyak dimanfaatkan sabagai dasar suatu analisis.

Beberapa analisis yang saat ini telah berbasis pada analisis DNA adalah identifikasi mayat, uji bapak kandung, dan berbagai pengujian lain. Langkah yang harus dilalui dalam suatu analisis yang berbasis DNA adalah isolasi atau ekstraksi DNA. DNA yang didapatkan dari isolasi DNA merupakan DNA yang terlarut pada pelarut. Pelarut untuk DNA biasanya adalah buffer TE (Tris-EDTA) atau aquadest.

Jumlah konsentrasi DNA hasil isolasi DNA tergantung dari jumlah sel yang diisolasi DNA nya, oleh karena itu untuk pengujian lebih lanjut perlu dilakukan pengukuran konsentrasi DNA. Salah satu uji lanjut yang hampir selalu dilakukan dalam analisis berbasis DNA adalah analisis PCR. Dalam analisis PCR, Konsentrasi DNA yang digunakan perlu diketahui terlebih dahulu karena konsentrasi DNA menentukan keberhasilan analisis PCR.

Baca Juga : Design Primer untuk PCR (Polimerase Chain Reaction)

DNA merupakan molekul yang berukuran sangat kecil sehingga tidak bisa dilakukan penghitungan langsung. Oleh karena itu proses penghitungan konsentrasi DNA memanfaatkan dari sifat DNA tersebut. Perlu diketahui bahwa suatu molekul atau senyawa mempunyai serapan yang khas terhadap berkas cahaya. Begitu juga dengan DNA, molekul DNA mampu menyerap berkas cahaya secara maksimal pada panjang gelombang 260 nanometer (nm). Hal tersebut dimanfaatkan untuk mengukur konsentrasi DNA dan alat yang dipakai adalah spektrofotometer.

Saat ini ada spektrofotometer khusus yang digunakan untuk mengukur konsentrasi DNA. Kelebihan dari spektrofotometer khusus tersebut adalah tidak membutuhkan kuvet seperti umumnya spektrofotometer dan tidak membutuhkan banyak sampel. Sampel yang digunakan cukup 1-2 µl. Sampel sebanyak 1-2 µl tersebut cukup diteteskan pada tempat sampel. Contoh merk dari spektrofotometer khusus untuk mengukur konsentrasi DNA tersebut salah satunya adalah NanoVue Plus Spectrophotometer.

Spektrofotometer khusus untuk DNA

Pengukuran konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer biasa yang menggunakan kuvet memerlukan beberapa tambahan langkah kerja. Tambahan langkah kerja tersebut adalah harus melakukan pengenceran dan perhitungan menggunakan rumus.

 Langkah tambahan dalam pengukuran tersebut adalah harus melakukan pengenceran dan penghitungan. Pengenceran yang dilakukan biasanya 10 hingga 100 x dan menggunakan aquadest steril. Kuvet spektrofotometer mempunyai kapasitas volume yang bermacam-macam sehingga volume larutan DNA yang dilarutkan tergantung dari kuvetnya.

Macam-macam ukuran kuvet

Misalnya =

* Pengukuran menggunakan kuvet 5 ml yang akan diisi sebanyak 3 ml. DNA diencerkan 100 x, maka pengenceranya adalah 30 µl DNA + 2970 µl  aquadest.

* Pengukuran menggunakan kuvet 1,5 ml yang akan diisi sebanyak 1 ml. DNA diencerkan 100 x, maka pengenceranya adalah 10 µl DNA + 990 µl aquadest.

 Baca Juga : Tahapan dan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)

Setelah diencerkan, dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm. Hasil pengukuran yang berupa nilai absorbansi kemudian dikonversi menjadi jumlah konsentrasi DNA dengan rumus =

Konsentrasi DNA (ug/ml) =  Absorbansi  λ 260 X faktor pengenceran X 50

50 adalah tetapan dari konsentrasi DNA, dihasilkan dari : 

A₂₆₀ of 1.0 = 50µg/ml pure dsDNA

artinya absorbansi 1,0 sampel DNA pada pengukuran spektrofotometer λ260 memiliki kandungan (konsentrasi) DNA sebanyak 50 ug/ml.

Contoh perhitungan =

Hasil pengukuran suatu sampel DNA dengan pengenceran100 kali pada panjang gelombang 260 adalah 0,0467 maka perhitungannya :

Konsentrasi DNA (ug/ml) =  Absorbansi  λ 260 X faktor pengenceran X 50

= 0,0467 x 100 x 50 = 233,5 ug /ml

Jadi Konsentrasi DNA dari contoh hasil pengukuran tersebut adalah 233,5 ug /ml.

Demikian postingan kali ini tentang Uji Konsentrasi DNA. SEMOGA BERMANFAAT

Read more

Penggunaan Bakteri Agrobacterium tumefaciens Sebagai Vektor Trasformasi Genetik

Bakteri Agrobacterium tumefaciens

Bakteri Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah anggota famili Rhizobiaceae yang bersifat patogen. Bakteri Agrobacterium tumefaciens digunakan dalam bidang bioteknologi sebagai vektor dalam transformasi gen karena memiliki kemampuan untuk mentransfer DNA yang berada pada Ti plasmid ke dalam inti sel tanaman melalui segmen T-DNA.  Proses infeksi bakteri A.tumefaciens terjadi pada jaringan tanaman yang luka sehingga T-DNA dapat masuk dalam jaringan tanaman.

Gen dan Ekspresi gen Bakteri Agrobacterium tumefaciens

Ekspresi T-DNA menyebabkan peningkatan produksi hormon (auksin dan sitokinin). Peningkatan produksi hormon tersebut memicu proliferasi abnormal pada tanaman sehingga terbentuk tumor (crown gall). Tumor yang dibentuk oleh tanaman selanjutnya mengeluarkan senyawa asam amino dan gula yang disebut dengan opine.

Senyawa opine yang terbentuk kemudian  dikonsumsi oleh bakteri Agrobacterium tumefaciens sebagai sumber karbon dan nitrogen. Selain itu Agrobacterium tumefaciens juga memiliki kemampuan untuk menggabungkan bagian tertentu dari DNA Ti plasmid kedalam genom tanaman inang melalui mekanisme yang terjadi secara alami. Karena kemampuannya tersebutlah Agrobacterium tumefaciens digunakan sebagai media dalam transformasikan gen kedalam sel tanaman.

Pada Ti Plasmid bakteri Agrobacterium tumefaciens terdapat gen – gen virulensi dan     gen – gen penyandi auksin, sitokinin, opine, serta octopine. Gen – gen virulens bertugas untuk membantu meningkatkan efisiensi transformasi gen pada tanaman, sedangkan gen penyandi auksin, sitokinin, opine, dan octopine berperan dalam pembentukan crown gall.

 Baca Juga : Organisme, Unsur, Atom dan Radioaktif

Modifikasi Ti Plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefaciens

Untuk meningkatkan efektivitas transformasi, Ti plasmid bakteri terlebih dahulu direkayasa dengan cara membuang gen-gen yang bereperan dalam pembentukan crown gall dan memasukkan gen-gen penting yang dibutuhkan untuk proses transformasi sehingga tidak menyebabkan terbentuknya tumor dan dapat dihasilkan tanaman transgenik dengan ekspresi gen yang diharapkan.

Modifikasi Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens agar dapat dimanfaatkan untuk transformasi genetik pada tanaman

Trasformasi genetik pada tanaman dengan menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens mempunyai banyak keuntungan, yaitu :

- teknik atau cara pengerjaannya mudah

- tanaman transgenik lebih stabil dan memiliki sifat fertil

- dapat dilakukan dengan peralatan laboratorium yang sederhana

Baca Juga : Polisakarida : Struktur glukosa, Selulosa dan Kitin

Mekanisme Tranformasi Genetik menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens

Mekanisme transformasi gen pada tanaman dengan vektor bakteri Agrobacterium tumefaciens diawali dengan pengenalan signal senyawa fenolik yang dikeluarkan bagian terluka tanaman oleh gen virulens A (vir A). gen virulens A merupakan antena periplasmik yang dapat mengenali senyawa fenolik (acetosyringone) dan gula yang dikeluarkan oleh bagian tanaman yang terluka.

Mekanisme transformasi T-DNA ke dalam jaringan tanaman dengan menggunakan vektor bakteri Agrobacterium tumefaciens

Pengaktifan gen virulens A (vir A) oleh senyawa fenolik dibantu oleh chv E (chromosomal virulence E). Protein chv E yang mengikat senyawa gula menjadi signal bagi histidine vir A kinase untuk mengaktifan vir A dengan cara autofosforilasi sehingga vir A dapat mengenali senyawa acetosyringone yang dikeluarkan oleh tanaman.

Aktifnya gen virulens A (vir A) secara langsung akan mengaktifkan site unactivated vir G melalui mekanisme transfosforilasi yang dimiliki oleh vir A. Pada proses ini Vir G merupakan aktivator dari gen-gen virulens lainnya seperti vir B, vir C, vir D, vir E, dan vir F yang kesemuanya ikut berperan serta dalam membantu integrasi T-DNA kedalam genom tanaman

Pengembangan bakteri Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor dalam proses transformasi hingga saat ini masih terus dilakukan untuk mengefisiensikan proses insersi goi pada genom tanaman. Hal ini dilakukan dengan cara memisahkan antara gen virulens yang terdapat pada Ti plasmid dengan T-DNA yang berisi goi pada plasmid yang berbeda, dimana sistem ini dinamakan dengan binary vector system.

T-DNA binary vector systems

Ti plasmid dan T-DNA dapat dipisahkan kedalam dua plasmid yang berbeda. Pemisahan ini dilakukan karena ukuran dari Ti plasmid A.tumefaciens sangat besar.

Demikian postingan Tentang Penggunaan Bakteri Agrobacterium tumefaciens Sebagai Vektor Trasformasi Genetik. Semoga bermanfaat. 

Kata Kunci : 

agrobakterium adalah, vektor agrobakterium, plasmid agrobakterium, transformasi genetik, transformasi genetik menggunakan agrobakterium, T-DNA agrobakterium, vektor agrobakterium, Bakteri Agrobacterium tumefaciens, Gen dan Ekspresi gen Bakteri Agrobacterium tumefaciens,  Modifikasi Ti Plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefaciens, Mekanisme Tranformasi Genetik menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens, 

Read more

Jenis Jenis Stem cell / Sel Punca (embryonic stem cell, Adult Stem Cell dan induced pluripotent stem )

Stem cell atau sel punca adalah sel yang belum berdiferensiasi. Stem cell atau sel punca dapat memperbanyak diri menghasilkan stem cell/ sel punca lain dan dalam kondisi yang sesuai juga dapat dapat berkembang menjadi sel-sel tertentu seperti  sel otot, sel darah, sel, kulit, sel hati dan lain-lain. Karena kemampuannya tersebut, Para ilmuwan secara intensif mempelajari tentang Stem cell / Sel Punca untuk dimanfaatkan sebagai pengobatan, sebagai contoh untuk perbaikan jaringan kulit yang rusak.

Ada dua jenis stem cell / sel punca yaitu stem cell / sel punca yang berasal dari embrio dan stem cell / sel punca yang berasal dari organisme dewasa.

Stem Cell / Sel Punca dari embrio (embryonic stem (ES) cells)

Embrio mempunyai banyak stem cell / sel punca yang dapat berkembang menjadi sel – sel lain. Stem cell / sel punca dapat diisolasi dari embrio pada saat embrio berkembang menjadi blastula / blastosit. Ketika dikulturkan dalam media, stem cell / sel punca yang berasal dari embrio akan terus menerus membelah membentuk stem cell / sel punca lain. Stem cell / sel punca dari embrio mempunyai kemampuan pluripotensi. Pluripotensi adalah kemampuan sel untuk berkembang menjadi semua tipe sel.

Baca Juga : Regulasi Ekspresi Gen Pada Eukariotik

Dengan penambahan suatu senyawa tertentu pada media kultur, Stem cell / sel punca dari embrio dapat berkembang menjadi semua tipe sel, seperti sel darah, sel tulang, sel syaraf, sel hati, sel sperma, sel telur dan sel-sel yang lain.

Gambar 1. Stem cell / sel punca dari embrio dapat berkembang menjadi semua tipe sel

Stem Cell / Sel Punca dari organisme dewasa (Adult Stem Cell)

 Organisme yang telah dewasa juga memiliki stem cell / sel punca. Contoh  stem cell / sel punca dari organisme dewasa adalah stem cell / sel punca yang ada pada sumsum tulang. Baru-baru ini para ilmuwan mempublikasikan hasil penelitian yang menyebutkan bahwa stem cell / sel punca terdapat pada jaringan otak, jaringan mata, jaringan rambut dan pulpa gigi.

 Namun stem cell / sel punca yang berasal dari organisme dewasa hanya bisa berdiferensiasi menjadi beberapa tipe sel, tidak dapat berdiferensiasi menjadi semua tipe sel, seperti stem cell / sel punca dari sumsum tulang. Stem cell / sel punca dari sumsum tulang hanya dapat berdiferensiasi menjadi sel darah merah, sel darah putih, trombosit namun tidak dapat berdiferensiasi menjadi sel-sel selain sel darah.

Gambar 2. Stem cell / sel punca dari embrio dapat berkembang menjadi semua tipe sel sedangkan Stem cell / sel punca dari organisme dewasa hanya bisa berkembang menjadi sel-sel tertentu

induced pluripotent stem (iPS)

Penelitian tentang stem cell / sel punca terus dikembangkan oleh para ilmuwan. Embryonic stem (ES) cell  mempunyai kemampuan pruripotensi. Kemampuan pruripotensi dari Embryonic stem (ES) cell  tersebut dapat dimanfaatkan untuk memahami mekanisme penyakit, screening obat yang cocok untuk berbagai penyakit dan cedera seperti penyakit diabetes pada anak-anak dan cidera tulang belakang. Namun Embryonic stem (ES) cell dianggap melanggar kode etik karena harus menggunakan sel-sel blastosist dari embrio. Oleh karena itu, para peneliti mulai mengembangkan induced pluripotent stem (iPS).

 Induced Pluripotent Stem (iPS) adalah stem cell / sel punca yang berasal dari sel yang telah berdiferensiasi. Sel yang telah berdiferensiasi tersebut diubah kembali menjadi stem cell / sel punca seperti stem cell / sel punca yang berasal dari embrio, yaitu memiliki kemampuan pluripotensi.

 Penelitian yang mengubah sel yang telah berdiferensiasi menjadi induced pluripotent stem (iPS) dilakukan oleh Shinya Yamanaka. Berkat penelitiannya tersebut, Shinya Yamanaka dan rekannya (John Gurdon) mendapat penghargaan Nobel pada tahun 2012. Shinya Yamanaka mengkulturkan stem cell / sel punca dari jaringan fibroblast hingga berkembang menjadi sel-sel fibroblast. Kemudian sel fibroblast tersebut diinsersi dengan 4 jenis regulator gen menggunakan vektor retrovirus. Hasilnya sel sel fibroblast tersebut berkembang menjadi stem cell / sel punca yang memiliki morfologi, pola proliferasi, anti gen permukaan (surface antigens), aktivitas telomerase yang sama dengan stem cell / sel punca dari embrio.

Gambar 3. Proses pembuatan induced pluripotent stem (iPS)

Saat ini para peneliti telah mampu mengidentifikasi gen yang dapat digunakan untuk mengubah suatu tipe sel (sel yang telah berdiferensiasi) menjadi tipe sel lain. Contoh yang telah berhasil dilakukan adalah para peneliti telah berhasil membiakkan sel fibroblast kulit menjadi sel sel saraf tanpa harus mengubahnya terlebih dahulu menjadi  induced pluripotent stem (iPS)

Demikian Postingan tentang Jenis Jenis Stem cell / Sel Punca (embryonic stem cell, Adult Stem Cell dan induced pluripotent stem ). Semoga bermanfaat

Kata Kunci :

Sel Punca dari embrio (embryonic stem (ES) cells), stem sel, stem cell, sel punca, sel punca adalah, stem cell adalah, stem sel, jenis jenis, sel punca, jenis jenis stem sel, jenis jenis stem cell, perbedaan stem cell / sel punca yang berasal dari embrio dan yang berasal dari organisme dewasa, Pluripotensi adalah, pengertian Pluripotensi, Induced Pluripotent Stem (iPS), Induced Pluripotent Stem (iPS) adalah, cara membuat stem cell,

Read more